一种无酚/无氯仿组织研磨从热带木本植物中提取核酸的方法

一种无酚/无氯仿组织研磨从热带木本植物中提取核酸的方法

概述：
    木本热带植物中含有大量复杂的有机化合物，这些有机化合物会抑制提取RNA或DNA所需的化学程序，从而不利于后续研究及应用，如RNA测序和基因表达分析。为了克服这个问题，研究人员必须使用CTAB / PVP缓冲液的提取方案，而不能使用市售的DNA / RNA提取试剂盒。但是，这种提取方式耗时长、需使用有毒化学品（例如苯酚和氯仿），并且一次只能处理少量样品。为了克服这些问题，我们开发了一种基于CTAB / PVP的新方法，用于RNA或DNA提取，去掉了传统方法中的苯酚/氯仿步骤。此外，该方法同样适用于96孔深孔板，使用SPEX高通量组织研磨仪，一次研磨6块深孔板，同时处理576个样品，大大加快了处理速度。
 
    我们的新方法，能够从夏威夷果、牛油果和芒果组织中，成功提取RNA，这些组织使用传统方法很难提取到RNA。而后我们还验证了，该方法提取的RNA成功地合成cDNA，以进行实时定量PCR并生成高质量的RNA-Seq库。该方法经轻微改动后，可用于从不同的热带和亚热带树种中快速提取DNA。
 
    这种方法可以更安全、更快速地从困难样品中提取DNA和RNA，从而为将来在热带树木上的研究提供了便利。

正文：
一、背景
分子实验揭示了植物物种的生理遗传结构和功能，使种植者能够在不断变化的环境条件下提高生产力。然而，从植物中提取的RNA或DNA的传统方法中，使用的是草本植物（如拟南芥），但这种方法并不能很好地使用在某些植物种类上。例如，热带树木的组织中含有的多糖和多酚类物质，会阻碍传统方法中核酸的提取。从这些物种中提取RNA或DNA通常依赖于使用苯酚和氯仿，但它们易挥发、毒性强，如果研究人员的经常使用，危害很大，是不适合作为常规方法的。因此，我们试图通过摸和方法
1、植物材料和组织研磨
从田间种植的牛油果树中收集了多种组织样本。哈斯·芒果品种：1243，夏威夷果品种：751，澳大利亚昆士兰州的咖啡和桉树。所有树木都已成熟（8至15岁）。从成熟叶片中提取DNA，而在茎，叶，根，花和腋芽组织上进行RNA提取。拟南芥品种：Columbia-0，豌豆品种：Torsdag，用于评估该方法对草本植物的有效性。
将新鲜样品在液氮或干冰中速冻，并在研磨成粉末（均质）之前，在-80°C下储存。冷冻的样品进行研磨，使用自动组织研磨仪（Geno /Grinder®2010，SPEX高通量组织研磨仪）。将叶、芽、花和根样品在2 ml样品管中研磨（每次最多96个样品），将茎组织在15 ml样品管中研磨（每次最多12个）。冷冻样品以1750 rpm的速度研磨1min，而后在−80°C的温度下冷冻30分钟，然后再循环破碎一或两次。使用刮刀将提取所需的粉末量（根据初步评估的体积/重量）转移到新的试管中。
 
2、溶液和试剂

• CTAB缓冲液：CTAB 2%，NaCl 1.4M，EDTA 20 mM，Tris–HCl 100 mM，PVP40 2％
• 异丙醇100％
• DTT（DL-二硫苏糖醇）0.5 mM
• SDS 10％
• 70％乙醇
• DNase Ⅰ+ DNase缓冲液
• RNase A

 
3、RNA提取
组织裂解
将0.5–50 mg（不用更多）的研磨样品转移到2 ml试管中。
加入625 µl CTAB缓冲液和25 µl DTT 0.5 mM（使用前将其混合）。
充分涡旋并在60°C下培养15分钟，每5分钟涡旋一次。
仅适用于困难样品：添加65 µl SDS 10％，并充分涡旋（如果只有少量组织，则仅添加40 µl SDS 10％） 注意：在此阶段，SDS与CTAB一起沉淀，使样品浑浊。
在室温下以20,000 g离心15分钟。 注意：组织碎片将在试管底部沉淀，SDS / CTAB将在表面形成半固体层。
从离心机中小心地移出试管，并将550–600 µl液相转移到新的2 ml管中或转移到96孔板中，然后进行核酸沉淀。 注意：1、如果错误地吸收了太多的顶层，请将样品放入新的2 ml试管中，然后重复此步骤（提示：第二次离心后，直接从试管的底部吸取样品，顶层会粘在移液枪的枪头的外侧）。 2、根据组织的不同，可能会形成不同的沉淀物（牛油果的芽就是这种情况）。此时转移到过滤柱（Qiagen QIAshredder或Macherey–Nagel NucleoSpin过滤器）中，而不是2 ml管中，并重复此步骤。
 
核酸沉淀
在每个管、深孔板孔、涡旋孔中加入550 µl预冷（-20°C）的异丙醇
在-20°C下放置15min。注意：在此阶段，您可以将样品在-20°C下放置几天或几周
样品管、深孔板在4℃下离心，深孔板1小时、3100g，样品管45分钟 20,000g。
倾斜管/板以除去异丙醇
加入1mL70％乙醇
在4°C下度离心10-15min（3100 g对深孔板，20,000 g对离心管）
倾斜管/板以除去乙醇
对深孔板/样品管短暂离心，并用移液管除去残留的乙醇
让样品在工作台上干燥10分钟。

DNase 处理
加入175 µl无RNase的水，上下吸匀，重悬沉淀
将深孔板在50–60°C下放置2–3分钟，快速涡旋
每个样品管或深孔板每个孔加入20 µl DNase和5 µl DNase I混合液（提前混合好的）。
快速涡旋，快速旋转并在37°C下培养20–30分钟
立即进行下一步。
 
RNA沉淀和洗脱
在每个管/孔中加入200 µl预冷（-20°C）异丙醇并涡旋孔
在-20°C下放置15min（注：在此阶段，您也可以将样品在-20°C下放置几天）
深孔板在3100 g、4°C离心1 h，样品管在20,000 g、4°C离心45 min
倾斜样品管/深孔板以除去异丙醇
加入1mL70％乙醇
在4°C下离心10-15分钟（对于深孔板3100g，对于样品管20000g）
倾斜样品管/深孔板以去除乙醇
短暂离心，并用移液枪除去残留的乙醇
让样品在工作台上干燥10min
加入40–100 µl温的（60°C）不含RNase的水，并用力上下吸匀
快速涡旋
通过凝胶电泳和分光光度法确定RNA的数量和质量，并将样品保存在-80°C。

4、DNA提取
组织裂解和RNase处理
将最多50 mg的初始样品转移到2 ml样品管中
加入400 µl CTAB缓冲液和4 µl RNase A + RNase缓冲液（如前所述提前混合好的）
37°C下充分涡旋1h，并每15分钟反转一次
加入30 µl 10％的 SDS，并充分涡旋（如果使用少量组织（<10–15 mg），则仅添加15 µl 10％的SDS）。（注意：SDS与CTAB一起沉淀，使样品浑浊）
在室温下以20,000 g离心15分钟。（注意：组织碎片将在试管底部沉淀，SDS / CTAB将在表面形成半固体层）
从离心机中小心取出，并将350–400 µl上清液转移到新的2 ml样品管中或2 ml 96孔板中，进行核酸沉淀。（注意：1、如果错误地吸收了太多的顶层，请将样品放入新的2 ml试管中，然后重复此步骤（提示：第二次离心后，直接从试管的底部吸取样品（顶层会粘在枪头的外侧）。2、视组织而异，如果形成脏/不清晰的沉淀物（牛油果的芽就是这种情况），需转移到过滤柱（Qiagen QIAshredder或Macherey-Nagel NucleoSpin过滤器）中，而不是2 ml试管中，然后重复此操作步。）
 
DNA沉淀和洗脱
向每个样品管/深孔板孔和涡旋孔中加入350-400 µl预冷（-20°C）的异丙醇
在-20°C下放置15min（注意：在此阶段，您也可以将样品在-20°C下放置几天）
4℃下离心，深孔板：3100g、1小时，样品管： 20,000g、45min
倾斜样品管/深孔板以除去异丙醇
加入70％乙醇1mL
在4°C下以3100 g的速度离心10-15min（对于深孔板）或20,000 g（对于离心管）
倾斜样品管/深孔板以除去乙醇
快速离心样品管/深孔板，并用移液枪除去残留的乙醇
让样品在工作台上干燥10min
加入90 µl温的（60°C）的无RNase的水，上下吸匀并充分涡旋以重悬沉淀。

5、数据统计与质量控制
通过在1.1％琼脂糖凝胶上电泳RNA或DNA样品进行质量控制。核酸通过加入Red Sage染色^®到凝胶。使用Gel Doc™系统（美国加利福尼亚州的Bio-Rad实验室）进行凝胶可视化。用NanoVue™ Plus分光光度计（GE Healthcare Life Sciences，宾夕法尼亚州，美国）测定样品的质量和纯度，测量RNA在280 nm和DNA在260nm的吸光度。
 
6、cDNA合成和定量实时PCR（qRT-PCR）
对于qRT-PCR，按照生产商的说明，通过在8 µl和2 µl的5×iScript Supermix（美国加利福尼亚Bio-Rad实验室）中使用250–500 ng的总RNA进行反转录获得cDNA。然后将cDNA稀释至每微升超纯水中0.5 ng当量RNA，用于工作模板溶液。然后定量实时PCR，每个反应试剂盒使用2微升的1mM的引物混合物，5μl cDNA和3μl SensiFAST™SYBR ®No-ROX Kit（Bioline）。按照生产商的说明扩增样品，并使用CFX384 Touch™实时PCR检测系统（美国加利福尼亚州Bio-Rad实验室）检测荧光。
 
7、cDNA合成和miRNA表达定量
为了定量miRNA的表达，按照生产商的说明，使用miScript Plant RT Kit（Qiagen，荷兰）试剂盒，通过连接反转录介质，从100到200 ng总RNA反转录合成低分子量cDNA。然后根据生产商的说明，使用超纯水稀释制备的cDNA，以实现最佳扩增。所述的qRT-PCR反应按照生产商的说明书（miScript SYBR Green PCR试剂盒，Qiagen，荷兰）进行使用：10μl的1×QuantiTect SYBR ®绿色主混合物，2微升1×miScript通用引物，2μl的0.8μM的miRNA特异性引物和2 µl模板cDNA。进行qRT-PCR运行，并使用Rotor-Gene Q 6000（Qiagen，荷兰）测量荧光。
 
8、RNA-Seq库的制备和测序
如Kerr等人所述制备RNA库的方式，准备牛油果、夏威夷果和芒果的茎、叶、根、花和腋芽组织。然后按照生产商的说明（Evrogen JSC，莫斯科，俄罗斯）使用Trimmer-2 cDNA标准化试剂盒对cDNA库进行标准化。使用CFX96 Touch™实时PCR检测系统（美国加利福尼亚Bio-Rad实验室），使用Illumina测序平台的库定量试剂盒（KAPA Biosystems，美国波士顿），通过qRT-PCR对库进行定量。使用从qRT-PCR计算的摩尔浓度将库标准化为4 nM的工作浓度，并调整片段大小。然后使用Illumina测序仪（NextSeq）对RNA-Seq样本进行测序。
 
9、RNA-Seq读取质量控制评估和定位
Trimmomtatic v. 0.35 用于去除启动子，根据质量修剪和过滤读取结果。使用Deconseq v. 0.4.2，从读取结果中去除序列污染物。使用FastQC（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）检查序列读取质量。
 
为了验证我们的RNA测序结果，我们将读段映射到已发表的转录组和基因组序列草案中。使用HISAT v.2（默认设置）将修剪的读取结果映射到已发布的参考转录组和基因组序列中。

三、结果
1、无苯酚/氯仿的CTAB / PVP / SDS-based RNA提取
在下面介绍的第一批实验中，我们开发并测试了一种使用40-60 mg牛油果、夏威夷果和芒果成熟叶片的冷冻叶组织提取RNA的方法。在发表的文献中，用于困难树种开发的大多数RNA提取方法，通过使用CTAB / PVP裂解缓冲液中调高盐（NaCl）浓度，可以提高RNA产量和质量。因此，我们使用该缓冲液裂解我们的样品。大多数提取方法都使用此缓冲液来提取RNA，同时联合使用苯酚/氯仿法从蛋白质中分离出核酸。但是，我们不使用苯酚和氯仿，因为它们具有毒性，同时它们不可能在96孔板中实现高通量。因此，我们决定通过加入一定量的异丙醇，并在裂解步骤后离心样品，来得到RNA沉淀（图1）。在这个阶段，蛋白质和不需要的化合物（如多糖和多酚）会溶解在上清液中，并且很容易可以除去。用乙醇洗涤沉淀后，将核酸重悬，并进行DNase处理，然后在异丙醇中进行另一轮沉淀并洗脱以回收RNA。图2中的质量控制显示RNA未被降解，并且260/280的比率高于1.79，表明提取过程中蛋白质被去除。260/230的比例在1.2至1.56之间，具体取决于物种，这表明残留了一些多糖。

 
为了改进方法，在60°培养步骤后将1％SDS添加到裂解缓冲液中。SDS是一种清洁剂，可帮助消化细胞膜并在此步骤中释放更多核酸。SDS还具有破坏核酸/蛋白质相互作用，并促进CTAB /核酸复合物溶解的特性，从而改善了核酸的沉淀并提高了产量。用SDS本身提取的样品获得的RNA产量比CTAB / PVP缓冲液更好。但是，260/230的比例非常低（1.07），无法防止样品氧化（图3a）。结合CTAB和SDS方法来改善产率（图2、3）。这在夏威夷果中尤为明显，其RNA产量几乎翻了一番。如通过裂解步骤后的样品颜色观察（图 3a），CTAB / PVP和SDS的组合也抑制了样品氧化和叶绿素变性，这是SDS的已知作用。CTAB和SDS之间的相互作用形成微胶束，产生可见的混浊沉淀，导致离心后在缓冲液和空气之间界面处形成半固体白色层。
因没有CTAB或样品管中有植物组织，SDS对产量的影响并未降低（图3）。这表明在该方法中，SDS对产量的影响可能是由于其从核酸中分离蛋白质的能力，而不是其组织裂解活性或其溶解CTAB /核酸复合物的性质。此外，添加SDS还可略微提高牛油果和夏威夷果的260/230比例，这表明CTAB和SDS的组合可在最终洗脱过程中稍微降低多糖含量（图3）。

 
2、从不同组织类型中提取RNA
然后，我们测试了该方法对于不同类型的组织是否有效。为了测试这一点，我们使用15–30 mg的四种不同夏威夷果组织（叶、茎、花、腋芽）进行了相同的步骤。质量/数量控制表明，该方法对夏威夷果的这四种组织类型均有效（图4）。还对根组织进行了测试，但结果不一致，不能认为是成功的（数据不包括在内）。从茎和休眠腋芽中提取的RNA量要少于从叶和花中提取的RNA，这可能是由于这种组织中所含的活细胞数量较少。对于所有组织，260/280均高于1.79，表明蛋白质已从样品中有效去除。260/230比值较低，这可能是由于这些组织类型中包含大量次要化合物。

 
3、使用96深孔板提取RNA
我们希望能开发一种可以同时提取大批量样本的方法。为了实现这一目标，我们注意到该方法的一个特点：在裂解步骤之后，该方法不需要在通风橱中进行移液，不像使用苯酚和氯仿的方法一样。因此，我们在2 ml 96深孔板上使用与样品管进行相同的步骤。与样品管结果相比，使用深孔板提取的结果令人满意，可以在图5中所示的质量控制结果看出。且使用96深孔板方法，仅需一天即可提取96个样品（不包括研磨时间），而使用96通道的移液器（PLATEMASTER，Gilson）可以使花费的时间更短。

 
4、实时定量PCR和RNA-Seq读取质量控制
为了证明提取方法所产生的RNA质量足够好，我们使用RNA进行实时定量PCR和RNA测序。用DORMANCY1（DRM1）和miR172在三种树种中获得的扩增（图 6）和解链曲线（附加文件1：图S1）证明，RNA可成功用于定量RT-PCR（图 6）。这些结果表明，即使在某些样品中260/230比值不是最佳的，用这种方法分离的RNA的质量也足以进行基因和miRNA定量分析。
为了进一步证明我们的RNA提取方法的适用性，我们使用该方法为牛油果、夏威夷果和芒果树中的每一种样品制备标准化的RNA-Seq库，并使用Illumina测序技术对其进行了测序。使用此方法获得的基因库质量控制数据表明，使用本文所述方法提取的RNA质量很好，完全满足RNA提取实验要求（图 7和附加文件2：图S2）。在使用Trimmomatic进行标准修整和质量控制后，使用FastQC版本0.11.5（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）进行质量评估，数据表明质量良好（图7），且具有统一的高质量碱基调用，以读取正向（图 7）和反向（附加文件2：图S2）序列的末尾。这说明大多数序列读数均为高质量，这为后续的遗传分析提供了保障。

 
5、序列映射检测
为了验证我们的RNA测序，我们使用HISAT v.2（默认设置）将修饰后的序列映射到已发布的转录组和基因组序列中（如表1）。我们牛油果样品中有76％和80％的读段映射到Persea americana var'drymifolia' and cv. ‘ Lisa’转录组序列集中。我们芒果样品的读段中有66％和69％映射到印度芒果（Mangifera indica L. cv. 'Shelly' and 'Zill'转录组序列集中。我们夏威夷果样品中有79％的读断映射到夏威夷果Madamadia integrifolia cv. 741 ‘Mauka’基因组序列集草案中。这种质量控制进一步支持了用我们的方法提取的RNA的质量足以进行各种转录组学研究。

 
6、无苯酚/氯仿的CTAB / PVP / SDS-based DNA提取
对树木进行DNA提取方法时通常遇到的问题与RNA提取方法相同。因此，我们决定测试这种RNA提取方法是否可以转换为基因组DNA提取方法。为实现此目的，我们通过用RNase代替CTAB缓冲液中的DTT来修改方法，以在裂解步骤中去除RNA。对于RNA提取，在裂解步骤结束时添加1％的SDS，并执行一次沉淀/洗涤/洗脱循环以回收纯化的DNA（图8）。我们的样品还包括来自室外种植的咖啡树和桉树的成熟叶片样品，这两个物种在DNA提取方面众所周知是有挑战性的。图9所示的是质量和数量控制结果，图示表明，所获得的提取量令人满意，并且提取的DNA没有降解。因此证明，该方法可以转化为困难的热带和亚热带物种样品的DNA提取方法。

四、结论
在过去的十年中，转录组测序的价格已大大降低，促使研究人员设计更大规模的实验。但是，用于木质热带物种的核酸提取的化学药品的毒性和不实用性，是这些样品进行大规模实验主要面临的问题。我们在此描述的方法可以降低这些问题的影响，并将促使人们进行更多大规模的实验，以便于研究在分子生物学中被认为是困难的物种。