新冠疫苗中mRNA成分和LNP递送系统的功能和特征及其对疫苗稳定性影响 mRNA疫苗概述 mRNA-LNP 疫苗的组成是其稳定性的基础。在针对新冠病毒的疫苗开发过程中，已经有多种不同的 mRNA 候选疫苗。目前，...
新冠疫苗中mRNA成分和LNP递送系统的功能和特征及其对疫苗稳定性影响
mRNA疫苗概述
mRNA-LNP 疫苗的组成是其稳定性的基础。在针对新冠病毒的疫苗开发过程中，已经有多种不同的 mRNA 候选疫苗。目前，有10种不同的针对新冠的mRNA疫苗已进入临床试验，包括常规 mRNA疫苗和自扩增 mRNA (SAM)。目前有三种“常规”可编码完整的S蛋白的mRNA 疫苗已获批或处于临床试验后期。它们是 Moderna 的 mRNA-1273 疫苗、BioNTech/Pfizer 的 BNT162b2/Comirnaty 和 CureVac 的 CVnCoV（可见表1）。
有几篇综述对这三种新冠的 mRNA疫苗进行了详细比较，包括它们在 mRNA 结构和LNP设计方面的差异和相似之处。以下部分旨在概述这些疫苗中mRNA 成分和 LNP递送系统的功能和特征，因为它们对 mRNA 疫苗的体内给药和储存期间的稳定性起着关键作用。
表1 有关目前上市使用或临床 III 期试验的三种 mRNA-LNP疫苗的信息，出于比较原因，添加了 Onpattro（一种 siRNA-LNP 药物产品）的药物产品信息。
* NDA 210922 ONPATTRO (patisiran) 脂质复合物注射液；药品质量审查附录（FDA，2017 年）。
a N = 可电离的阳离子脂质（氮），P = 核苷酸（磷酸盐）。
b推测
2.1 优化mRNA体内稳定性和翻译能力的mRNA工程
mRNA由于其磷酸基团上带有负电荷，在生理 pH 范围内是以聚阴离子大分子的形式存在。递送mRNA 疫苗的第一个障碍是由于核糖核酸酶在细胞外环境中含量丰富，裸露的mRNA在注射后容易被核糖核酸酶 (RNase) 迅速降解。其次， mRNA进入细胞会被细胞内RNA受体识别，包括内体Toll 样受体 (TLR) 和细胞质核酸受体。mRNA与这些宿主防御受体的结合会激活先天免疫通路，会导致数百个基因的表达。一方面，这可以为疫苗提供佐剂样作用。另一方面，它导致细胞处于抗病毒状态，这强烈降低了细胞内mRNA的稳定性和翻译表达。摄取进入细胞后， mRNA 链需要与核糖体结合以实现所编码蛋白质的翻译表达。可以通过mRNA工程显著改善mRNA 的蛋白质合成速率和功能半衰期，mRNA疫苗中的mRNA链的典型元件示意图如图1所示。
图1 体外转录 (IVT) mRNA 的结构元件。这些序列中的每一个部分都可以优化和修改，以调节mRNA 的稳定性、翻译能力和免疫激活能力。
有很多研究尝试提高mRNA 分子的体内稳定性和翻译能力，同时避免不需要的先天免疫激活。目前达成共识的是，这可以通过优化 mRNA 的调控区域5' 帽、poly-A 尾和非翻译区 (UTR)来实现。UTR位于mRNA 编码区的两侧，可以调节mRNA的稳定性和翻译。
poly-A尾也能调节mRNA的稳定性，因为它的缩短和去除都会导致 mRNA 的降解。5' 帽结构对于蛋白质生产和翻译启动子的结合很重要。此外，具有最大化 GC（鸟嘌呤-胞嘧啶）含量的mRNA 结合密码子优化，即在编码区选择“常用密码子”，可提高稳定性和翻译水平。
另一个关键因素是mRNA的二级结构，它可以通过密码子优化和计算工具来改变一级序列使其稳定。通过选择“高度结构化的编码序列”在mRNA中构建二级结构 （除了5' UTR 区域）也会产生更高的体内翻译水平，因为mRNA体内半衰期得到延长。或者，Mauger等人证明天然存在的修饰尿苷的引入，例如使用1-甲基-假尿苷（m1Ψ）代替尿苷，会带来mRNA二级结构的整体变化，从而达到更高水平的蛋白质表达。
重要的是，目前将RNA结合蛋白对mRNA的胞内识别降至最低的最有效方法是在mRNA中引入这些修饰的尿苷，这些蛋白参与对外来mRNA的先天免疫反应，反过来增强了生物稳定性和翻译能力，同时降低了mRNA 疫苗的免疫原性。此外，还有迹象表明，m1Ψ 提高了mRNA 的碱基堆积和熔点，从而使mRNA更加稳定。
这可能意味着 Moderna 和 BioNTech/Pfizer 的新冠疫苗，1mΨ的掺入也会提高给药前mRNA 的稳定性。最近有文章发表了对 CureVac在 CVnCoV mRNA 工程中所做工作的有趣分析，CureVac 采用了不同的策略。然而，即使优化了mRNA的结构，直接注射裸露的mRNA 也不会引起强烈的免疫反应，这可能是因为裸露的mRNA的细胞转染能力差和对RNA酶（RNase）敏感。这说明仅优化mRNA结构不足以创建有效的 mRNA 疫苗，仍然需要额外的保护和递送系统。
另一种类型的 mRNA 疫苗SAMs不仅编码目标抗原，还编码RNA 聚合酶——来自病毒的“自我放大”因子。通常，SAMs由 9 kb 的mRNA核苷酸组成，而非自我复制的mRNA疫苗的序列长度仅为2-4 kb。开发 SAM 候选疫苗的目的是替代典型的两剂策略的“启动-加强”方案，而是达到每位接种者单次注射。由于自带的复制能力，SAM疫苗的注射剂量低于传统mRNA疫苗，一剂便可能达到足够保护效力。
当 SAM 在宿主细胞中被翻译时，一种RNA聚合酶合成与编码mRNA 模板互补的反义RNA中间体，再转录为许多编码mRNA 分子，从而使抗原表达延长和增强。目前两种 SAM 疫苗都编码完整的S 蛋白，并且这些疫苗在临床试验中的最高剂量比常规mRNA 疫苗的典型剂量低十倍以上。临床开发中的两种SAM 疫苗是伦敦帝国理工学院的nCoVsaRNA 和 Arcturus/Duke-NUS 的 ARCT-021，两种疫苗均采用的是LNP包裹技术。
mRNA-LNP 疫苗的组成是其稳定性的基础。在针对新冠病毒的疫苗开发过程中，已经有多种不同的 mRNA 候选疫苗。目前，有10种不同的针对新冠的mRNA疫苗已进入临床试验，包括常规 mRNA疫苗和自扩增 mRNA (SAM)。目前有三种“常规”可编码完整的S蛋白的mRNA 疫苗已获批或处于临床试验后期。它们是 Moderna 的 mRNA-1273 疫苗、BioNTech/Pfizer 的 BNT162b2/Comirnaty 和 CureVac 的 CVnCoV（可见表1）。
有几篇综述对这三种新冠的 mRNA疫苗进行了详细比较，包括它们在 mRNA 结构和LNP设计方面的差异和相似之处。以下部分旨在概述这些疫苗中mRNA 成分和 LNP递送系统的功能和特征，因为它们对 mRNA 疫苗的体内给药和储存期间的稳定性起着关键作用。
表1 有关目前上市使用或临床 III 期试验的三种 mRNA-LNP疫苗的信息，出于比较原因，添加了 Onpattro（一种 siRNA-LNP 药物产品）的药物产品信息。
* NDA 210922 ONPATTRO (patisiran) 脂质复合物注射液；药品质量审查附录（FDA，2017 年）。
a N = 可电离的阳离子脂质（氮），P = 核苷酸（磷酸盐）。
b推测
2.1 优化mRNA体内稳定性和翻译能力的mRNA工程
mRNA由于其磷酸基团上带有负电荷，在生理 pH 范围内是以聚阴离子大分子的形式存在。递送mRNA 疫苗的第一个障碍是由于核糖核酸酶在细胞外环境中含量丰富，裸露的mRNA在注射后容易被核糖核酸酶 (RNase) 迅速降解。其次， mRNA进入细胞会被细胞内RNA受体识别，包括内体Toll 样受体 (TLR) 和细胞质核酸受体。mRNA与这些宿主防御受体的结合会激活先天免疫通路，会导致数百个基因的表达。一方面，这可以为疫苗提供佐剂样作用。另一方面，它导致细胞处于抗病毒状态，这强烈降低了细胞内mRNA的稳定性和翻译表达。摄取进入细胞后， mRNA 链需要与核糖体结合以实现所编码蛋白质的翻译表达。可以通过mRNA工程显著改善mRNA 的蛋白质合成速率和功能半衰期，mRNA疫苗中的mRNA链的典型元件示意图如图1所示。
图1 体外转录 (IVT) mRNA 的结构元件。这些序列中的每一个部分都可以优化和修改，以调节mRNA 的稳定性、翻译能力和免疫激活能力。
有很多研究尝试提高mRNA 分子的体内稳定性和翻译能力，同时避免不需要的先天免疫激活。目前达成共识的是，这可以通过优化 mRNA 的调控区域5' 帽、poly-A 尾和非翻译区 (UTR)来实现。UTR位于mRNA 编码区的两侧，可以调节mRNA的稳定性和翻译。
poly-A尾也能调节mRNA的稳定性，因为它的缩短和去除都会导致 mRNA 的降解。5' 帽结构对于蛋白质生产和翻译启动子的结合很重要。此外，具有最大化 GC（鸟嘌呤-胞嘧啶）含量的mRNA 结合密码子优化，即在编码区选择“常用密码子”，可提高稳定性和翻译水平。
另一个关键因素是mRNA的二级结构，它可以通过密码子优化和计算工具来改变一级序列使其稳定。通过选择“高度结构化的编码序列”在mRNA中构建二级结构 （除了5' UTR 区域）也会产生更高的体内翻译水平，因为mRNA体内半衰期得到延长。或者，Mauger等人证明天然存在的修饰尿苷的引入，例如使用1-甲基-假尿苷（m1Ψ）代替尿苷，会带来mRNA二级结构的整体变化，从而达到更高水平的蛋白质表达。
重要的是，目前将RNA结合蛋白对mRNA的胞内识别降至最低的最有效方法是在mRNA中引入这些修饰的尿苷，这些蛋白参与对外来mRNA的先天免疫反应，反过来增强了生物稳定性和翻译能力，同时降低了mRNA 疫苗的免疫原性。此外，还有迹象表明，m1Ψ 提高了mRNA 的碱基堆积和熔点，从而使mRNA更加稳定。
这可能意味着 Moderna 和 BioNTech/Pfizer 的新冠疫苗，1mΨ的掺入也会提高给药前mRNA 的稳定性。最近有文章发表了对 CureVac在 CVnCoV mRNA 工程中所做工作的有趣分析，CureVac 采用了不同的策略。然而，即使优化了mRNA的结构，直接注射裸露的mRNA 也不会引起强烈的免疫反应，这可能是因为裸露的mRNA的细胞转染能力差和对RNA酶（RNase）敏感。这说明仅优化mRNA结构不足以创建有效的 mRNA 疫苗，仍然需要额外的保护和递送系统。
另一种类型的 mRNA 疫苗SAMs不仅编码目标抗原，还编码RNA 聚合酶——来自病毒的“自我放大”因子。通常，SAMs由 9 kb 的mRNA核苷酸组成，而非自我复制的mRNA疫苗的序列长度仅为2-4 kb。开发 SAM 候选疫苗的目的是替代典型的两剂策略的“启动-加强”方案，而是达到每位接种者单次注射。由于自带的复制能力，SAM疫苗的注射剂量低于传统mRNA疫苗，一剂便可能达到足够保护效力。
当 SAM 在宿主细胞中被翻译时，一种RNA聚合酶合成与编码mRNA 模板互补的反义RNA中间体，再转录为许多编码mRNA 分子，从而使抗原表达延长和增强。目前两种 SAM 疫苗都编码完整的S 蛋白，并且这些疫苗在临床试验中的最高剂量比常规mRNA 疫苗的典型剂量低十倍以上。临床开发中的两种SAM 疫苗是伦敦帝国理工学院的nCoVsaRNA 和 Arcturus/Duke-NUS 的 ARCT-021，两种疫苗均采用的是LNP包裹技术。
